Le criblage fonctionnel génotypé de clones Fab solubles permet

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 13107 (2023) Citer cet article

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Les anticorps monoclonaux (mAb) et leurs fragments sont largement utilisés en thérapeutique, en diagnostic et en recherche fondamentale. Bien que les méthodes d’affichage telles que la présentation sur phage offrent un haut débit, les affinités des anticorps individuels doivent être mesurées avec précision dans un format soluble. Nous avons développé une plate-forme de criblage capable de fournir des données fonctionnelles génotypées à partir d'un total de 9 216 clones de fragments de liaison à l'antigène (Fab) individuels et solubles en employant le séquençage de nouvelle génération (NGS) avec indexation hiérarchique. Des séquences de domaines variables appariées (VL – VH) complètes sont liées aux données de dépistage fonctionnel, permettant une analyse approfondie des effets de la mutation. La plate-forme a été appliquée à quatre projets de criblage scFv/Fab sélectionnés par exposition sur phage et à un projet de maturation d'affinité VH par saturation de site. Le criblage fonctionnel génotypé a simultanément permis l'identification de mutations améliorant l'affinité dans le domaine VH du Fab 49A3, reconnaissant la protéine non structurale 1 (NS1) du sérotype 2 du virus de la dengue et informant sur les positions des résidus VH qui ne peuvent pas être modifiées par rapport au type sauvage sans diminuer l'affinité. L'identification basée sur le génotype nous a révélé l'étendue de la variance du signal intraclonal inhérente aux données de dépistage en un seul point, un phénomène souvent négligé dans le domaine. De plus, le criblage génotypé a éliminé la sélection redondante de génotypes identiques pour une étude plus approfondie et a fourni un nouvel outil d'analyse pour évaluer le succès des sélections de présentation sur phage et la diversité clonale restante dans les répertoires criblés.

L’ingénierie des anticorps recombinants est une réussite dans le domaine de la biotechnologie. Les anticorps monoclonaux (mAb) et leurs fragments, tels que le fragment variable à chaîne unique (scFv) et le fragment de liaison à l'antigène (Fab), sont largement utilisés en thérapeutique, en diagnostic et comme outils de recherche fondamentale1. À mesure que de nouvelles molécules cibles pour ces applications sont découvertes, des liants nouveaux ou améliorés présentant une affinité, une spécificité et des propriétés physicochimiques souhaitées élevées sont nécessaires.

La plus petite taille des fragments d’anticorps et l’absence du domaine Fc offrent plusieurs avantages par rapport aux IgG de taille réelle, notamment une meilleure pénétration tissulaire2,3 et un risque moindre d’interférence dans les tests de diagnostic in vitro4. Du point de vue de l’ingénierie des anticorps, le principal avantage de la structure simple des fragments d’anticorps est leur expression économique et facile dans E. coli, permettant leur utilisation dans la présentation sur phages5. Les technologies avancées de bibliothèques de gènes d’anticorps recombinants6,7, combinées à des méthodes d’affichage à haut débit, offrent un moyen efficace d’enrichir des liants contre une grande variété de cibles8.

Bien que les méthodes d’affichage aient un débit élevé, l’affinité et la spécificité des liants individuels doivent être évaluées par le criblage d’un grand nombre d’anticorps individuels sous forme soluble. Une perte de spécificité a été rapportée dans certaines études après la conversion des fragments d'anticorps présentés sur les phages en format soluble9,10. Cela pourrait s'expliquer par une conformation altérée du scFv après la perte du support de la protéine pIII, qui est le partenaire de fusion le plus courant du scFv pour l'affichage10. Il existe également des rapports sur la perte d’affinité après conversion directe du format scFv au format IgG11,12, limitant considérablement les domaines d’application des anticorps découverts. De plus, la multimérisation involontaire des scFv conduit à une liaison plus forte via des effets d'avidité, ce qui n'est pas souhaité dans le panoramique ou le criblage soluble . Les Fab, cependant, sont généralement considérés comme des molécules monomères, ce qui constitue le format de criblage idéal pour les tests d'affinité et, bien que l'existence de particules de phage avec plusieurs Fab affichés ne puisse être exclue, le risque d'enrichissement dû aux effets d'avidité est plus faible avec Fab qu'avec scFv. bibliothèques de phages13. En plus d'une estimation fiable de l'affinité, le criblage soluble permet l'identification de clones présentant de bons niveaux d'expression.

3) among the phage display selected libraries. Among genotypes encountered at least three times in the screening campaign, 66.7% did not bind to the SpyCatcher-antigen (S/B < 3), whereas, of the remaining genotypes, 28.9% showed S/B-ratio both above and below the set threefold threshold ratio, and 4.4 % were positive (S/B > 3) in all instances (6.7% if calculated by S/B > 2). On the contrary, anti-DARPin library was over enriched in relation to the number of clones screened, with only 76 unique genotypes, 43% of which were represented between 2 and 331 times with a standard deviation (SD) of 47. Three genotypes, including one used as control, were present with 170 clones or more. The low number of unique clones in the anti-DARPin Fab repertoire is consistent with the selection scheme, as four rounds of Fab-phage selections were carried out with the anti-DARPin library in contrast to three with anti-SpyC library and one to two with anti-NP libraries. The genotype copy numbers per library are shown in Fig. 2b./p> 3) and distribution of functional screening data differed between the phage-derived screening projects. Despite undergoing 4 + 4 rounds of phage display, it appears that the anti-SpyCatcher library was not fully enriched and could have potentially benefited from an additional round of phage display selection or a reconsideration of the selection strategy. The selection campaign involved various antigens, including chemically biotinylated SpyCatcher, scFv-SpyCatcher, and in vivo biotinylated Spy- and SdyCatcher proteins, aiming to enhance binding towards the catcher rather than the SA-biotin linker. The insufficient enrichment is evidenced by the low number of identical genotypes in the screened set and a relatively low hit rate of 13%. Low hit rate can also be seen in the distribution of the functional signal data (Fig. 2), which is heavily bottom weighted. In the remaining three projects, the hit rates were higher and also the shared genotypes more abundant. In the case of the anti-DARPin library the selection could have been screened after the 3rd round instead of the 4th round of panning, as only a few genotypes were represented in the data, which also had a quite evenly distributed functional signal. NP-1 and NP-2 both come from the same Fab-converted phage library origin, but the functional data between them is very different, with NP-2 having more evenly distributed signals between clones. This was expected, as the last two selection rounds and assay formats were different. NP-2 Fabs were first bound on the wells, followed by addition of biotinylated antigen and detected with Eu-labeled streptavidin, whereas NP-1 Fabs were selected to bind antigen captured by the control Fab N1G1, and the presence of E. coli-expressed Fab-APs was detected with europium-labeled anti-alkaline phosphatase antibody./p>