Développement d'une biobanque Plasmodium vivax pour des tests fonctionnels ex vivo

Malaria Journal volume 22, Numéro d'article : 250 (2023) Citer cet article

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Plasmodium vivax est la deuxième cause la plus répandue de paludisme, mais reste difficile à étudier en raison de l'absence d'un système de culture in vitro continue, soulignant la nécessité d'établir une biobanque d'isolats cliniques avec plusieurs congélations par échantillon pour une utilisation dans des tests fonctionnels. Différentes méthodes de cryoconservation des isolats de parasites ont été comparées et la plus prometteuse a ensuite été validée. L'enrichissement en parasites aux stades précoce et avancé et la maturation des parasites ont été quantifiés pour faciliter la planification des essais.

Afin de comparer les protocoles de cryoconservation, neuf isolats cliniques de P. vivax ont été congelés avec quatre mélanges à base de glycérolytes. La récupération des parasites après décongélation, après enrichissement en KCl-Percoll et en culture in vitro à court terme a été mesurée par microscopie sur lame. L'enrichissement en parasites à un stade avancé par tri cellulaire activé magnétique (MACS) a été mesuré. Le stockage à court et à long terme des parasites à -80 °C ou à l'azote liquide a également été comparé.

Parmi les quatre mélanges de cryoconservation, un mélange (glycérolyte: sérum: RBC dans un rapport de 2,5: 1,5: 1) a entraîné une amélioration de la récupération du parasite et une amélioration statistiquement significative (P <0,05) de la survie du parasite dans une culture in vitro à court terme. Une biobanque de parasites a ensuite été générée à l’aide de ce protocole, aboutissant à une collection de 106 isolats cliniques, chacun contenant 8 flacons. La qualité de la biobanque a été validée en mesurant plusieurs facteurs issus de 47 dégels : la réduction moyenne de la parasitémie post-dégel (25,3 %) ; le facteur d'enrichissement moyen après KCl-Percoll (6,65 fois) ; et le pourcentage moyen de récupération des parasites (22,0 %, mesuré à partir de 30 isolats). Au cours d'une culture in vitro à court terme, une maturation robuste des parasites au stade annulaire jusqu'aux stades ultérieurs (> 20 % de trophozoïtes, schizontes et gamétocytes) a été observée dans 60,0 % des isolats au bout de 48 h. L'enrichissement des stades parasitaires matures via MACS a montré une bonne reproductibilité, avec une moyenne de 30,0 % de parasitémie post-MACS et une moyenne de 5,30 × 105 parasites/flacon. Enfin, l'effet de la température de stockage a été testé et aucun impact important d'un stockage à court terme (7 jours) ou à long terme (7 à 10 ans) à − 80 ° C sur la récupération, l'enrichissement ou la viabilité des parasites n'a été observé.

Ici, une méthode de congélation optimisée pour les isolats cliniques de P. vivax est démontrée comme modèle pour la génération et la validation d’une biobanque de parasites destinée à être utilisée dans des essais fonctionnels.

Plasmodium vivax est l’espèce de parasite du paludisme la plus répandue géographiquement et est responsable du deuxième fardeau le plus élevé du paludisme au monde. Bien que l'incidence totale de P. vivax ait diminué à l'échelle mondiale, passant de 20,5 millions de cas en 2000 à 4,9 millions de cas en 2021 [1], des obstacles importants subsistent dans les efforts visant à éradiquer cet agent pathogène, notamment l'absence de vaccin contre P. vivax et la résistance croissante à ce pathogène. médicaments antipaludiques.

La recherche sur la biologie fondamentale de P. vivax a été sévèrement limitée en raison de l'absence d'un système de culture in vitro continue [2,3,4]. Ce manque de culture continue nécessite l'utilisation d'isolats cliniques de P. vivax pour des investigations expérimentales, et l'accès limité à ces isolats a entravé les progrès dans l'avancement des connaissances sur ce parasite. Récemment, des approches de culture in vitro à court terme pour P. vivax ont été établies (y compris dans certains cas l'utilisation d'isolats cryoconservés) [3, 5, 6], permettant d'effectuer des tests de résistance aux médicaments en un seul cycle [3, 7] ainsi que des tests d'invasion pour évaluer le tropisme des réticulocytes de l'hôte [8], les effets des anticorps inhibiteurs d'invasion [9,10,11,12,13,14,15,16] et des mutants du récepteur de l'hôte [17, 18]. L’importance des biobanques d’échantillons de maladies infectieuses [19,20,21], notamment de Plasmodium falciparum [22,23,24], est de plus en plus reconnue. La génération d'une biobanque d'isolats cryoconservés de P. vivax pouvant être décongelés de manière fiable pour des expérimentations en aval (analyses fonctionnelles, analyses d'expression génique, génomique) serait une ressource essentielle pour de nouveaux progrès dans le domaine [4].

0.01% were included for further analysis. The blood was centrifuged at 800g for 5 min at room temperature, and serum from each isolate was separated and stored at − 80 °C for related studies. The pelleted blood was washed using phosphate buffered saline (Thermo Fisher Scientific, USA, #J61196.AP) supplemented with 0.5% (w/v) bovine serum albumin (Millipore Sigma USA, #10735086001) to separate any leftover serum components. Prior to cryopreservation, the pelleted blood was separated from leukocytes, by running the sample through CF-11 column filters prepared in the lab. Smears were prepared post processing with CF-11 to assess parasite stages and to examine the leukocyte removal. De-leukocyted samples were cryopreserved using Glycerolyte 57 (Baxter/Fenwal USA, #4A7833), added as follows: glycerolyte 57:serum:RBC ratio was 2:0:1 for mixture 1 [7], 2.5:1.5:1 for mixture 2 [35, 39], 1.66:0:1 for mixture 3 [36] and 4.15:1.5:1 for mixture 4. Samples were stored in cryovials (Fisher Scientific USA, #50001020) at − 80 °C for 24 h prior to long-term storage in liquid nitrogen cryo-tanks at − 196 °C. The serum used in the study was heat-inactivated AB + pooled plasma (Access Biologicals, USA, #A17054) collected from a non-malaria endemic region./p> 80% are infected with P. vivax [42]. The ability to collect this number of P. vivax isolates has made GMC a unique setting to develop a biobank of cryopreserved parasites for future experimentation. From 2012 to 2016, over 700 P. vivax isolates were cryopreserved using the method from Kosaisavee et al. [7], where a 2:1 ratio of the cryoprotectant glycerolyte:RBCs was used. Other ratios of glycerolyte:RBCs have been reported in the literature for cryopreservation of both P. falciparum and P. vivax (Additional file 1: Table S1). Four cryopreservation mixtures, derived from established cryopreservation protocols [7, 34, 36, 39], (Fig. 1A) that varied in the ratios of glycerolyte:RBCs (with or without the addition of serum) were tested in order to identify any differences from the established 2:1 glycerolyte:RBC ratio./p> 50%) of either immature parasites (early and late rings) or maturing parasites (trophozoites, schizonts and gametocytes) (Fig. 3B). Post enrichment, all isolates had at least 20% immature parasites. At 24 h, 57.9% (11/19) had > 20% mature stages, and a subset of 26.3% (5/19) had > 50% mature stages. These proportions did not change appreciably as by 48 h, 60% of isolates (12/20) had > 20% mature stages with 30% (6/20) having > 50% mature stages./p> 0.2% parasitaemia [3]) was demonstrated (Fig. 1C). The measured recovery of parasites using this method is still relatively low (Fig. 1E), suggesting that other improvements to this approach may be possible. Future experiments should also directly measure the recovery of reticulocytes (both uninfected and infected) as well as the effectiveness of recovery and maturation of sexual stages [49], which may be useful for future transmission studies./p>