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Nature Communications volume 14, Numéro d'article : 5294 (2023) Citer cet article

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Saccharomyces cerevisiae est un cheval de bataille de la biotechnologie industrielle en raison de l'importance de l'organisme dans la fermentation alcoolique et de la suite d'outils génétiques sophistiqués disponibles pour manipuler son métabolisme. Cependant, S. cerevisiae n'est pas adapté à la surproduction de nombreux bioproduits en vrac, car la toxicité limite la production à des titres élevés. Ici, nous utilisons un test à haut débit pour cribler la tolérance à 20 g L−1 d’acide adipique (AA), un précurseur du nylon, de 108 souches de levure accessibles au public. Nous identifions 15 levures tolérantes et sélectionnons Pichia occidentalis pour la production d'acide cis,cis-muconique (CCM), le précurseur de l'AA. En développant une boîte à outils d'édition du génome pour P. occidentalis, nous démontrons la production par lots de CCM avec un titre maximum (38,8 g L−1), un rendement (0,134 g g −1 de glucose) et une productivité (0,511 g L−1 h−1 ) qui surpasse toutes les mesures obtenues avec S. cerevisiae. Ce travail nous rapproche de la bioproduction industrielle d’AA et souligne l’importance de la sélection de l’hôte dans les bioprocédés.

Historiquement, la levure de bière (Saccharomyces cerevisiae) a été l'hôte microbien préféré de la surproduction de carburants, de produits chimiques et de produits pharmaceutiques. Cependant, en raison de la faible valeur de nombreux produits chimiques en vrac et biocarburants, les concentrations requises pour une production à l'échelle commerciale sont souvent toxiques pour S. cerevisiae et d'autres organismes modèles. Par exemple, S. cerevisiae est incapable de maintenir sa croissance à des concentrations faibles à modérées de butanol (2 %)1, de vanilline (0,05 %)2, de benzaldéhyde (0,1 à 0,2 %)3 et de nombreux acides organiques (0,25 à 2,5 %). 4,5,6. Les acides organiques posent un défi distinct en matière de biotraitement, car un bioprocédé idéal d'acide organique serait réalisé à un pH acide, ce qui simplifie la récupération en aval de la forme non dissociée et évite l'exigence de maintenir le pH pendant la fermentation. Cependant, la toxicité acide est inversement proportionnelle au pH, car les acides non dissociés (pH < pKa) diffusent librement dans les cellules et se dissocient dans le cytosol (pH 5–7)7. En conséquence, pour éviter la toxicité du produit, la culture de la plupart des souches productrices d'acide organique de S. cerevisiae et d'autres microbes est réalisée à un pH > pKa8,9,10.

L'acide adipique est un acide dicarboxylique en C6 utilisé dans la production de nylon 6,6. Avec une production annuelle de trois millions de tonnes et un marché mondial de six milliards USD11, l'acide adipique a été classé comme « super-produit » par le ministère américain de l'Énergie12. La demande mondiale d'acide adipique est actuellement satisfaite par un processus chimique impliquant du cyclohexane et de l'acide nitrique, mais cette méthode utilise des ressources pétrochimiques et libère de l'oxyde nitreux, un puissant gaz à effet de serre, ce qui incite à rechercher des voies de production plus durables. Il n’existe pas de voies naturelles pour la biosynthèse de l’acide adipique, mais au moins huit voies biochimiques artificielles ont été proposées pour sa bioproduction11. Parmi ces voies, des progrès majeurs ont été réalisés grâce à la voie de l'acide cis,cis-muconique (CCM). Cette stratégie utilise trois enzymes hétérologues, la 3-déhydroshikimate déshydratase, la protocatéchique décarboxylase et la catéchol dioxygénase, pour la synthèse du CCM à partir du 3-déhydroshikimate, un intermédiaire de la voie du shikimate. Le CCM est converti en acide adipique via l'hydrogénation par les enzymes énoate réductase, mais les variantes bactériennes caractérisées à ce jour fonctionnent mal chez les levures hôtes13, atteignant une conversion molaire <0,9 % du CCM en acide adipique14. En l'absence d'énoate réductase active dans la levure, S. cerevisiae a été conçu pour synthétiser du CCM avec un titre, un rendement et une productivité allant jusqu'à 22,5 g L−1, 0,1 g g−1 de glucose et 0,21 g L−1. h−1, respectivement9,10. Malgré ces progrès, les processus CCM de levure sont effectués à un pH de 5 à 6, ce qui est bien supérieur au pKa du CCM (3,87) et maintient l'acide sous sa forme dissociée pour limiter la toxicité du produit.

En réponse à la faible tolérance de S. cerevisiae à de nombreux bioproduits en vrac, l'accent s'est déplacé vers le criblage d'espèces de levure non conventionnelles pour des phénotypes mieux adaptés aux applications industrielles15. La sélection des souches est un aspect critique et souvent négligé du développement des bioprocédés, car la sélection d'un hôte microbien adapté au produit final cible est susceptible de réduire les interventions d'ingénierie des souches, de simplifier la séparation en aval, de limiter la toxicité du produit et d'améliorer les paramètres globaux du processus16. Par exemple, Yarrowia lipolytica est un hôte oléagineux et osmotolérant bien adapté à la production d'acides gras et d'alcanes17, Kluyveromyces marxianus est une levure thermotolérante à croissance rapide18 et Pichia kudriavzevii est un hôte robuste tolérant aux acides utilisé pour la production de divers acides organiques19. Environ 1 500 espèces de levures ont été classées dans plus de 100 genres et les référentiels publics de cultures contiennent des milliers de souches de levures distinctes. La majorité de ces espèces de levures peuvent être cultivées en laboratoire avec des milieux standards20 et des progrès majeurs en matière de séquençage du génome, de biologie des systèmes et d’ingénierie des souches ont considérablement réduit le coût et la main-d’œuvre impliqués dans la domestication génétique d’hôtes non conventionnels. Des boîtes à outils génétiques sophistiquées ont été développées pour diverses espèces de levures, notamment Y. lipolytica21, K. marxianus18 et P. pastoris22, offrant de nouvelles opportunités de sélection d'hôtes au-delà de Saccharomyces.