Biologie des communications volume 6, Numéro d'article : 885 (2023) Citer cet article
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Les vésicules extracellulaires (VE) se sont révélées être des médiateurs clés du transport extracellulaire des petits ARN. Cependant, les porteurs d’ARN messager acellulaire (cf-ARNm) dans les biofluides humains et leur association avec le cancer restent mal compris. Ici, nous avons effectué une analyse transcriptomique du plasma fractionné selon la taille provenant du cancer du poumon, du cancer du foie, du myélome multiple et de donneurs sains. L'analyse de la morphologie et de la distribution granulométrique a montré une séparation réussie des particules de grande et moyenne taille des autres fractions de protéines plasmatiques solubles. Nous avons développé une stratégie pour purifier et séquencer des quantités ultra-faibles d'ARNm cf provenant de sous-populations enrichies en particules et en protéines avec la mise en œuvre de pics d'ARN pour contrôler la variabilité technique et normaliser les différences intrinsèques drastiques dans la quantité d'ARNm cf transportée dans chaque fraction plasmatique. Nous avons constaté que la majorité des cf-ARNm étaient enrichis et protégés dans les véhicules électriques avec une stabilité remarquable dans des environnements riches en RNase. Nous avons observé des modèles d'enrichissement spécifiques en ARNm-cf associé au cancer dans chaque sous-population enrichie en particules et en protéines. Les gènes différenciateurs enrichis en EV étaient associés à des voies biologiques spécifiques, telles que le système immunitaire, la fonction hépatique et la régulation des substances toxiques dans le cancer du poumon, le cancer du foie et le myélome multiple, respectivement. Nos résultats suggèrent que la dissection de la complexité des sous-populations EV met en lumière leur signification biologique et offre une approche prometteuse de biopsie liquide.
L’ARN acellulaire (cfRNA), également connu sous le nom d’ARN extracellulaire (exARN), est présent dans de nombreux fluides corporels, notamment le liquide céphalo-rachidien (LCR), la salive, le sérum, l’urine et le plasma1,2,3. Les biotypes de cfRNA les plus fréquemment signalés sont les petits ARN non codants (ARNnc), qui comprennent les microARN (miARN), les fragments d'ARN de transfert (ARNt) et les ARN interagissant avec les piwis (piARN)4. Des études ont également découvert des ARN messagers (ARNm) et des ARN longs non codants (ARNlnc) dans les biofluides5,6,7,8,9. Alors que le cfRNA a été considéré comme plus fragile et moins abondant que l’ADN acellulaire en raison des taux élevés de RNase dans le sang10, plusieurs études ont démontré que les miARN présents dans le sang sont remarquablement stables11,12. De nombreuses études sur les cfRNA se sont concentrées sur la caractérisation des cf-miARN en raison de leur stabilité dans les fluides corporels11,12. Cependant, nous et d’autres avons récemment démontré que les cf-ARNm peuvent également porter des signatures stables et spécifiques à une maladie qui peuvent être exploitées comme biomarqueurs non invasifs8,13,14,15,16,17,18.
Les cfRNA sont associés à plusieurs sous-classes de porteurs, notamment les vésicules extracellulaires (EV), les ribonucléoprotéines, ainsi que les lipoprotéines telles que : les chylomicrons, les lipoprotéines de très basse densité (VLDL), les lipoprotéines de basse densité (LDL) et les lipoprotéines de haute densité (HDL). Les types et proportions de cargaisons d’ARN emballées dans différents transporteurs peuvent dépendre du type de biofluide, de facteurs pré-analytiques et des conditions physiologiques ou pathologiques. Le NIH Extracellular RNA (exRNA) Communication Consortium a créé une ressource atlas exRNA qui a comparé de manière approfondie les principaux porteurs de miARN par déconvolution informatique dans 19 études2,19. Ces études statistiques comparatives ont identifié cinq types de cargaisons de miARN associés à des porteurs vésiculaires et non vésiculaires connus2. Alors que ces études impliquaient les EV comme médiateur clé du transport de l’ARN, d’autres ont montré que les complexes protéiques de liaison à l’ARN peuvent transporter des miARN indépendamment des vésicules dans le plasma humain12,13,20. L'identification des porteurs d'ARNm cf qui assurent la stabilité dans le plasma riche en RNase peut révéler la biologie et la fonction fondamentales, ainsi qu'une forme distincte potentielle de biomarqueurs spécifiques au porteur pour des applications cliniques. Dans des milieux de culture cellulaire conditionnés, il a été démontré que l’ARNm-cf était associé aux EV13,20. Cependant, les porteurs associés à l’ARNm cf dans le biofluide humain restent mal caractérisés1,21.
0.05; *P < 0.05, **P < 0.01, and ****P < 0.0001) with three technical replicates of FR14 and FR58 of plasma pooled from three healthy individuals. c A box plot of negative raw cycle threshold (- raw ct) of individual genes with RNase and/or detergent treatment using qRT-PCR. RNA isolated from combined FR14 and FR58 using three healthy individuals and three technical replicates of control RNA were treated with RNase and/or detergent. Data are analyzed using RStudio and reported as means ± SD of three independent samples./p> 1) between each cancer type and healthy controls within a specific fraction (Fig. 5a). We used permutation tests to evaluate the statistical significance of DE analysis (Supplementary Fig. 9). To analyze the enrichment patterns, we calculated fold change of these DE genes identified between each cancer type compared with controls within each fraction and visualized in a heatmap (Fig. 5a). We found that, compared to healthy controls, the fractionated plasma of lung cancer patients had significantly upregulated mRNAs, specifically 136, 199, 462, 151, 105, and 7 within medium EVs, small EVs, non-EV particles, early-, middle-, and late-eluting protein fractions respectively (Supplementary Fig. 10a). Intriguingly, the heatmap visualization of fold changes in cancer patients compared with healthy controls displayed distinct enrichment patterns of lung cancer-differentiating cf-mRNA, specific to EV and protein subpopulations (Fig. 5b). The majority of DE genes are enriched in specific EV and protein fractions with very few DE mRNA being shared between fractions (Supplementary Fig. 10). To assess the potential roles of these selectively enriched cancer distinguishing gene sets in each plasma fraction, we performed pathway enrichment analysis using g:Profiler curated on gene ontology and Reactome databases, Cytoscape, and EnrichmentMap (Fig. 5a). Differentiating genes enriched in FR14 (medium EVs) from lung cancer were associated with both immune system and metabolic process (Fig. 5c), while DE genes enriched in FR912 (non-EV particles fraction) were implicated in the immune system and myeloid leukocyte mediated response (Fig. 5c). Differentiating genes enriched in FR1619 (early-eluting protein) from lung cancer were enriched in protein localization nucleus, steroid hormone corticosteroid, and defense virus symbiont, while DE genes enriched in FR3033 (late-eluting protein) were enriched in sphingolipid metabolism (Fig. 5c)./p> 1). After DE genes were identified, log2 fold change (log2FC) was calculated by subtracting log2 counts of cancer from individual biological replicates to the mean of corresponding healthy fractions. Gene lists were organized by fraction. DE genes were identified for selective packaging heatmap analysis. Using the DE genes identified from each fraction, g:Profiler was performed on gene ontology biological properties and reactome for functional enrichment analysis. Pathway enrichment analysis was performed using Cytoscape and EnrichmentMap. b Heatmap of gene expression in lung cancer relative to healthy across fractions. c Enrichment map for lung cancer DE genes found in individual fractions using Gene Ontology (Biological properties) and Reactome with FR14, FR912, FR1619, and FR3033 color coded by red, green, purple and yellow, respectively. Cluster represents (i) steroid hormone corticosteroid, (ii) Cellular response chemical, (iii) defense virus symbiont, (iv) regulation myeloid cell, (v) negative regulation response, (vi) toll cell receptor 4, (vii) g1 specific transcription, and (viii) hemidesmosome assembly. Cluster of nodes were automatically labeled using the AutoAnnotate from Cytoscape./p> 1) per cancer type compared to healthy controls within each fraction. Intriguingly, our heatmap visualization of enrichment patterns revealed distinct multiple cancer differentiating cf-mRNA specific to EV and protein fractions (Fig. 6a). Although there is a slight increase in expression of cf-mRNA between small EV-associated lung cancer DE genes with multiple myeloma and liver cancer, the majority of these genes were not differentially expressed within multiple myeloma and liver cancer. In addition, we performed functional enrichment analyses on these combined gene sets and found the majority of biological function related terms were unique for each cancer type and fraction with minimal overlap on humoral response antimicrobial from both FR14 of lung cancer and FR2326 of multiple myeloma (Fig. 6b). These overall selective enrichment patterns associated with multiple cancers within EV subpopulations and protein fractions suggests that distinct cf-mRNA are packaged into different types of extracellular carriers in cancer./p> 1. To test the significance of the differential expression results for each pairwise comparison of cancer to healthy control per fraction, we performed a permutation test in which differential expression analysis between two groups of randomized samples was compared using the DESeq2 package. For each pair, 1000 permutations of random shuffling were performed and the number of differentiating genes with padj < 0.05 were documented for building a histogram, and compared to the number of significant genes (padj < 0.05) for the group with correct labeling./p> 1 from DESeq2 (v1.22.2). For DegPattern analysis from R package DEGreport (v1.18.1), a total of 11,577 differentially expressed genes determined by one-way ANOVA test across plasma fractions with false discovery rate less than 0.05 were used./p>
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